研究内容

Ca2+シグナルの基本機構から脳機能を探る

Ca2+シグナルは普遍的で基本的な情報伝達機構です。私達はこれまでに、Ca2+シグナルの多機能性を担う多様な時空間動態の形成基盤を明らかにしてきました。この研究成果を基盤とし、組織・個体レベルでの生体機能とりわけ脳機能の理解に現在取り組んでいます。

神経細胞は複雑な樹状突起や軸索を持ち、細胞内の局所的なシグナル現象の解析が必須です。そのため、可視化法が極めて有効です。私達はCa2+シグナル上流のイノシトール三リン酸の可視化解析に成功し、シナプスにおける新規Ca2+シグナル経路を明らかにしました。また脳組織においてCa2+シグナル下流の一酸化窒素(NO)の可視化に成功し、NOの新たなシグナル経路と機能的意義を追究しています。加えて、最も重要な興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸の可視化に挑戦し、シナプス近傍における時空間動態や、大脳皮質における感覚入力依存的グルタミン酸動態のin vivo可視化に成功しました。このようなCa2+および関連シグナル研究の新たなモダリティーを利用して、中枢神経機構に迫りたいと考えています。さらに、独自に確立したCa2+シグナルの特異的抑制法を用い、Ca2+シグナルが関与する未知機能探索を中枢神経系で行っています。これにより、これまでに活動依存的シナプス維持機構や神経・グリア相互作用について新たな発見を行い、分子基盤の同定と生体内での意義の解明を目指しています。

このような研究に興味がある方は随時飯野(iino[at]m.u-tokyo.ac.jp)あてメールを下さい。

研究内容について以下に詳しく説明します。

  1. これまでの研究の流れ
  2. Ca2+シグナルの基本機構研究
  3. Ca2+シグナルの可視化研究
  4. Ca2+関連シグナルの可視化研究
  5. Ca2+シグナルの未知機能探索
  6. 組織・個体レベルへの展開
  7. 基本的立場

0. これまでの研究の流れ

Ca2+シグナルは、主要な生理機構には必ずといっていいほど関与する極めて重要なシグナル分子です。いくつか例を挙げてみましょう。まず、生命誕生の発端である受精に際して卵細胞内でCa2+シグナルが形成されます。さらに、発生にも、免疫にも、Ca2+シグナルは重要であることが示されています。骨格筋の収縮を制御して、私達が自由に運動できるようにしているのはCa2+シグナルです。また、一時も休み無く、血液を送り続ける心臓では、拍動ごとにCa2+シグナルが働いていますし、血管平滑筋細胞内のCa2+シグナルによって血圧が制御されます。さらに、神経伝達物質やホルモン、あるいは唾液や膵液などの分泌をコントロールしているのもCa2+シグナルです。中枢神経系でもCa2+シグナルは重要な役割を果たしています。神経伝達物質の放出に必須なことに加えて、良く知られているのはシナプス可塑性です。シナプス可塑性は記憶や学習の素過程とされていますので、Ca2+シグナルなしでは、私たちの脳は環境に順応できず新たな知的創造を行うこともできないわけです。このように、Ca2+シグナルは、ミリ秒から時間、日という幅広い時間単位の様々なかつ重要な生体機能の制御に関わっています。さらに、Ca2+シグナルが制御している機能は、未知のまま多数残されています(図1)。

図1 Ca2+シグナルの多機能性と未知機能

図1 Ca2+シグナルの多機能性と未知機能

Ca2+という単純な分子が、このような多様で、しかも重要な機能を制御できるというのは、驚嘆に値します。私達は、Ca2+制御機構の解明を通じて、細胞機能制御機構の本質に迫りたいと考えています。

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1. Ca2+シグナルの基本機構研究

細胞内Ca2+シグナル形成は、細胞膜に存在するCa2+チャネルを介して細胞外から細胞内へのCa2+の流入によるものと、細胞内Ca2+ストア(小胞体)からCa2+放出チャネルを介して細胞質へ放出される2通りの経路によります。Ca2+放出チャネルには、イノシトール三リン酸(IP3)受容体(IP3R)と、リアノジン受容体(RyR)という2種類の分子が関与しています。IP3RもRyRもほ乳類では3種の遺伝子によりコードされていますが、相同な遺伝子であり、一つの遺伝子が2通りに進化してきたものと考えられます(図2)。

図2 Ca2+放出機構

図2 Ca2+放出機構

私たちは、まずCa2+放出チャネルの基本メカニズムについて研究を開始しました。さらに、全てのCa2+放出チャネル遺伝子について細胞レベルあるいはマウスでノックアウトした標本も用いて、それぞれの機能を詳細に研究してきました。特に、IP3受容体の活性化には、IP3だけでは不十分で、同時にCa2+が要である事を明らかにしました。これは、IP3受容体を介するCa2+放出にフィードバック制御機構があることを示しており、Ca2+シグナルのダイナミックスを考える上で必要不可欠な研究成果として、その後のCa2+シグナル研究に大きな影響を与えています。

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2. Ca2+シグナルの可視化研究

Ca2+シグナル研究は、蛍光Ca2+インジケーターの発達により、可視化研究が最も先に進展した領域です。Ca2+シグナルの可視化は、最初は単離細胞や培養細胞でのみ行われていましたが、私達は生きた組織の中の個々の細胞内Ca2+シグナルを可視化する事に初めて成功しました。これにより、単離細胞におけるアーチファクトではないかと疑われる事も多かったCa2+オシレーション(細胞内Ca2+濃度の振動現象)が、生理的な現象である事がはっきりしました。

IP3受容体には3種のサブタイプがあり、性質が少しずつ異なりますが、サブタイプ毎に違ったパターンのCa2+オシレーションを起こすことを私達は発見しました。私達はIP3受容体上のCa2+センサー領域を同定することにも成功しており、この領域に変異を導入してIP3受容体のCa2+感受性を低下させると、Ca2+オシレーションが抑制されることを実験的に示し、Ca2+放出のフィードバック制御がCa2+シグナルパターン形成に重要であることを明確にしています。また、細胞質のCa2+濃度測定に加え、小胞体内腔およびミトコンドリア内腔のCa2+濃度を同時に測定する事により、Ca2+オシレーションの形成機構を明らかにしました。さらに、タンパク質型のCa2+インジケーターをベースにして、小胞体内腔およびミトコンドリア内腔のCa2+測定に最適化されたインジケーターを開発しました。特に、蛍光波長の異なる3種類のインジケーターが利用可能となったことにより、細胞質、小胞体、ミトコンドリアの3画分の同時Ca2+測定も可能となりました。これを、神経細胞に応用して、シナプス入力に伴う小胞体内腔のCa2+動態の観測に成功し、

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3. Ca2+関連シグナルの可視化研究

Ca2+シグナルと一口に言っても、その時間的・空間的パターンでその細胞内シグナルとしての意味が全く異なることが分ってきました。それでは、シグナルの意義が、時間的・空間的パターンに依存するということは、Ca2+シグナルに限った特殊なことでしょうか?そうとは言いきれません。そこで、Ca2+以外のシグナル分子についても新たな可視化プローブを作製して時空間動態を解析し、生体機能制御機構を研究してきました(図3)。

図3 Ca2+と関連シグナル:イメージングによる時空間解析

図3 Ca2+と関連シグナル:イメージングによる時空間解析

IP3の可視化

まず、私達はCa2+シグナルの上流にあるIP3動態の可視化に成功しました。驚くべきことに、IP3も細胞内でダイナミックに動き、「IP3ウエーブ」や「IP3オシレーション」が見られることを発見しています。さらに、この方法を神経細胞に応用して、細胞膜の脱分極に伴う新しいIP3シグナル機構を発見しました。また、シナプス入力に伴うIP3シグナルを可視化し、従来考えられていたように代謝型グルタミン酸受容体だけでなく、イオンチャネル型グルタミン酸受容体もIP3シグナル形成に関与することを示しました。

NFATの可視化

一方、Ca2+オシレーションによってコードされる情報を細胞がどのように解釈するのかという基本的問題も重要です。Ca2+依存性に脱リン酸化されると核内に移行してIL-2などの転写を制御するNFATについて、細胞内局在とCa2+シグナルの関係を解析しました。この結果、脱リン酸化NFATはCa2+シグナルの作業記憶素子(平均寿命7分)として機能することが明らかになっています。従って、Ca2+オシレーション頻度が増加するとともに、シグナル作業記憶素子である脱リン酸化NFATが細胞質に蓄積し核内移行が促進されます。このような分子的な記憶素子を用いたメカニズムによって、Ca2+オシレーション頻度のデコーディングが行われることを私達は明らかにしました。さらに、この研究により、Ca2+オシレーションは細胞の負担を減らして効率よく機能を制御する方法であることも明らかになりました。

NOの可視化

続いて、一酸化窒素(NO)の可視化のためのインジケーターを可溶性グアニル酸シクラーゼのヘム結合部位を基本として新たに開発しました。これにより、小脳内で、平行線維からプルキンエ細胞へのシナプス入力に伴うNOシグナルの可視化という画期的な実験に成功しました。これにより、NOシグナルは従来考えられていたような広範囲なシグナル分子ではないということが判明しました。さらに、NOシグナルは、平行線維の刺激周波数に二相性に依存すると言う思いがけない結果が明らかになりました。また、このNOシグナルは、平行線維→プルキンエ細胞シナプスの長期増強(LTP)を惹起し、LTPもやはり平行線維入力周波数に二相性に依存することが明らかになりました(図4)。

PYK2の可視化

PYK2はFAK (Focal Adhesion Kinase)ファミリー分子で、Ca2+依存性のチロシンリン酸化酵素です。シナプス可塑性との関連も示唆されている事から、PYK2を可視化したところ、細胞境界の接着焦点に局在して細胞を後退させる事が分りました。この際に同時にCa2+シグナルも必要な事が分り、それを探索したところ、細胞間の接触面に限局する自発的Ca2+シグナル(Ca2+ライトニング、Ca2+雷光)を発見しました。これは、細胞間の接触を感知するメカニズムと考えられ注目されます。

グルタミン酸シグナルの可視化

グルタミン酸は、中枢神経系における最も重要な伝達物質です。私達は、グルタミン酸動態を可視化できるインジケーターを開発しました。これを用い、シナプスから放出されるグルタミン酸動態の可視化に取り組み、脳におけるグルタミン酸シグナルの可視化に初めて成功しました。

このような先端的可視化解析を進めるには、インジケーターを新規に開発するなど新たな方法論の開発が重要です。同時に、それに適した顕微鏡法を選択する必要があります。共焦点顕微鏡や落射蛍光顕微鏡はもちろんのこと、二光子励起顕微鏡、エバネッセント顕微鏡、表面反射顕微鏡など目的に応じた顕微鏡法を使用しています。

図4 小脳平行線維→プルキンエ細胞シナプスにおけるシグナル伝達

図4 小脳平行線維→プルキンエ細胞シナプスにおけるシグナル伝達

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4. Ca2+シグナルの未知機能探索

Ca2+シグナルが制御する未知細胞機能はまだ多数残されています。私たちは、この未知機能を明らかにし、Ca2+シグナル研究の地平を拡大したいと考え、研究を開始しています。既に成果が得られ始めています。

小脳の平行線維→プルキンエ細胞シナプスにおいて、プルキンエ細胞のIP3-Ca2+シグナルが、BDNFを介してシナプス機能を維持している事を明らかにしました(図4)。これは、シナプスを使用し続ける事がシナプス機能維持に重要である事を示しています。また、アストロサイトにおける自発Ca2+オシレーションが、アストロサイト表面分子の発現レベルを調節する事により、神経突起伸長を制御する事も明らかにしました。さらに研究を進めて、分子機構を同定するとともに、生体内での意義について明らかにしたいと考えています。小脳バーグマングリアにおけるCa2+シグナル機構の新たな機能も明らかにしています。

NOが細胞内Ca2+ストアからCa2+放出を起こすことを明らかにし、この機構がシナプス可塑性および神経細胞死に関与することを明らかにしました。

脳に対する機械的な障害に伴い、アストロサイトでCa2+濃度が上昇し、N-cadherinの発現上昇を介して、活性化アストログリオーシスと神経保護作用が生じることを明らかにしました。

軸索の活動に伴う、細胞外ATPシグナルを介したシュワン細胞内Ca2+シグナルが、髄鞘形成に必要なミトコンドリア機能を制御するでことを示しました。

さらに新たな未知機能の発見につなげようとわくわくしているところです。

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5. 組織・個体レベルへの展開

新たな機能制御メカニズムを研究する上で、分子・細胞レベルの解析力は極めて強力であり、必要不可欠です。一方、研究解析の対象が、細胞・分子レベルのみで閉じるのでは、不十分であると考えています。私たちは、細胞・組織レベルのイメージング法において様々なイノベーションを達成してきましたが、細胞間のコミュニケーションを維持した状態(組織レベル)でのシグナル伝達を解析するという立場を、さらに積極的に取り入れていきたいと考えています。また、個体レベルの解析も必要だと考えています。このためには、組織レベルのイメージングはもちろんのこと、個体レベルにおけるイメージングや分子遺伝学的方法も必要と考えています。現在では、生きたままのラットやマウスの脳内でグルタミン酸イメージングを行えるようになっています。

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6. 基本的立場

私たちは、複雑なメカニズムを分りやすく目の当たりにできるような、面白い研究を目指しています。また、生命の謎の根幹に迫る、基本的なメカニズムを明らかにしたいと考えています。


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